Postoje skoro sve kompanije koje su prodalebromelain enzimski prahje pomiješan sa papainom. Teško je pročistiti bromelain do 5000GDU/g. ali je vrlo lako prečistiti papain do 1000,000GDU/g. čak i do 2000.000 GDU/g. ali funkcije bromelaina se razlikuju od papaina. boja, miris, rastvorljivost u vodi i ukus su u suprotnosti sa lažnim i pravim proizvodom. Razlika je u tome što je pravi bromelain enzimski prah siv, bez mirisa, ukusa i nerastvorljiv u vodi.
Ali lažni bromelain ima sljedeće karakteristike:
● Svetložut je, aromatičan i blago sladak, rastvorljiv u vodi. To je karakteristika papaina.
● Koristi se za smanjenje upale i ublažavanje bolova. ali ovih funkcija u papainu gotovo da i nema.
● Koristi se samo kao dodatak ishrani, ne kao dodatak hrani, ali zaista može biti farmaceutski. Ali papain se koristi samo kao prašak za omekšavanje mesa i kozmetika.
Testirali smo bromelain prema SDS-PAGE gelu i GELATIN DIGESTION UNIT ANALYTICAL i HPLC metodama, ima manje ciljnih molekula u SDS-PAGE gel metodi za lažni proizvod.
Slijede rezultati elektroforeze SDS stranice
Tačkice u gornjem tekstu pokazuju da samo pravi proizvod ima istu tačku na pravom mjestu na slici, ali lažni proizvod ima male mrlje na sebi, što znači da je molekularna težina jedva vidljiva.
Molekularna težina bromelaina je oko 33000, ali molekularna težina papaina je 21000. I HPLC hromatogram:
Vidjet ćete da samo pravi ekstrakt sadrži pravu molekularnu težinu bromelaina i da se može detektirati pomoću HPLC.
Ali ako smo testirali samo analitičkom metodom jedinice za varenje želatina (GDU) pogledajte Aneks II. I pravi i lažni proizvod imaju iste rezultate kao u nastavku:
Stabljika ananasa je vrlo jeftina, a stopa od stabljike do bromelaina je vrlo niska, postoji određeno zagađenje u procesu proizvodnje.
Gotovo sve fabrike bromelain enzima u prahu su blizu polja. Koriste svježu stabljiku. Nemoguće je otpremiti stabljiku na velike udaljenosti. Sirovinom treba rukovati što je prije moguće kada se sakupi sa polja ili ga treba čuvati u okruženju niske temperature (4-8 stepen) kako bi se izbjegla degradacija proteina. U stvarnom životu, proizvođač zapravo ne može ispuniti nijedan od dva gore navedena uvjeta zbog prevelike količine stabljika ananasa. Razumna metoda je balans između vremena rukovanja i gubitka proteinske aktivnosti. Obično, proizvodnja sirovih sirovina u sezoni berbe ananasa, i skladištenje sirovih sirovina u okruženju niske temperature (4-8 stepen).
Radimo neke testove o elektroforezi SDS stranice, teoretski možemo to povećati na 10,000 ili 20,000.ali to će biti veoma skupo. 5000GDU/g i učiniti ga stabilnim možda na malto podlozi / mikrokapsuliranom ili nečemu plus ekstrakcija/prečišćavanje organskog kvaliteta.
Aneks I
● Metoda 5 SDS elektroforeza na poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE)
SDS-PAGE je metoda elektroforeze denaturiranog poliakrilamidnog gela. Princip odvajanja proteina u ovoj metodi zasniva se na činjenici da se većina proteina može kombinovati sa anionskim surfaktantom natrijum dodecil sulfatom (SDS) u težinskom omjeru kako bi se formirao kompleks
Negativni naboj koji nose proteinski molekuli daleko premašuje neto naboj prirodnih proteinskih molekula, eliminirajući učinak naboja različitih proteinskih molekula i razdvajajući proteine prema njihovoj molekularnoj veličini.
Ova metoda se koristi za kvalitativnu identifikaciju, kontrolu čistoće i nečistoća i kvantitativno određivanje proteina.
1 Instrument uređaj
Napajanje konstantnog napona ili konstantne struje, rezervoar za elektroforezu sa vertikalnim pločama i kalup za izradu ljepila.
2. Reagensi
(1) Voda.
(2) Pufer za odvajanje gela (4x, rastvor A) 1,5mol/L pufer trihidroksimetil aminometan hlorovodonične kiseline. Odvažite 18,15 g trihidroksimetil aminometana i otopite ga s odgovarajućom količinom vode. Podesite pH vrednost na 88 hlorovodoničnom kiselinom i razblažite vodom do 100 ml.
(3) Izvagati 58.0g akrilamida i 20g N,N'-metilen bisakrilamida u 30% rastvoru akrilamida (B rastvor), rastvoriti u toploj vodi i razblažiti do 200ml, filtrirati filter papirom (čuvati u tamno).
(4) Izvagajte 10 g natrijum dodecil sulfata u 10-postotnom rastvoru SDS (C rastvor), rastvorite u vodi i razblažite do 100 ml
(5) Reagens za komercijalizaciju rastvora tetrametiletilendiamina (TEMED, D rastvor).
10% rastvor amonijum persulfata (E rastvor) Odmerite 10 g amonijum persulfata, rastvorite u vodi i razblažite do 100 ml. Preporučljivo je pripremiti ga prije upotrebe ili čuvati odvojeno na -20 stepeni 2 sedmice.
(7) Koncentrovani gumeni pufer (4 ×, F rastvor) 0.5mol/L Trihidroksimetilaminometan pufer hlorovodonične kiseline, odmeriti 6,05g trihidroksimetilaminometana, dodati odgovarajuću količinu vode da se rastvori, podesiti pH vrednost na 6,8 hlorovodoničnom kiselinom kiseline i razblažite vodom do 100 ml.
(8) Pufer za elektrode (10 ×) Odvažite 30 g trimetilaminometana, 144 g glicina i 10 g natrijum dodecil sulfata, rastvorite ih u vodi i razblažite do oko 800 ml. Podesite pH vrijednost na 8.1-8.8 hlorovodoničnom kiselinom i razblažite vodom do 1000 ml.
(9) Neredukovani pufer za uzorke (4 ×) Odvažite 303g trimetilaminometana, 20mg bromofenol plavog i 8,0g natrijum dodecil sulfata, izmjerite 40ml glicerola, otopite u vodi i razrijedite do oko 80ml. Podesite pH na 68 hlorovodoničnom kiselinom i razblažite vodom do 100 ml.
(8) Pufer za elektrode (10 ×) Izvagajte 30 g trimetilaminometana, 144 g glicina i 10 g natrijum dodecil sulfata, rastvorite u vodi i razblažite do oko 800 ml. Podesite DH vrijednost na 81-88 sa hlorovodoničnom kiselinom i razrijedite na 1000 ml s vodom
(9) Neredukovani pufer za uzorke (4 ×) Izvagajte 3,03 g trimetilaminometana, 20 mg bromofenol plavog i 80 g natrijum dodecil sulfata, izmerite 40 ml glicerola, rastvorite u vodi i razblažite do oko 80 ml. Podesite pH na 6,8 hlorovodoničnom kiselinom i razblažite vodom do 100 ml.
(10) Pufer redukovane ispitivane supstance (4 ×) Izvagajte 3,03 g trimetilaminometana, 20 mg bromofenol plavog i 80 g natrijum dodecil sulfata, izmerite 40 ml glicerola, rastvorite i razblažite vodom do oko 80 ml i dodajte - 20ml merkaptoetanola, hlorovodoničnom kiselinom podesiti pH na 6,8, razblažiti vodom do 100 ml (ili 3,03 g trimetilaminometana, 20 mg bromofenol plavog, 8,0 g natrijum dodecil sulfata, izmeriti 40 ml, rastvoriti glicerol u vodi i rastvoriti glicerol na 80ml, podesiti pH na 6,8 hlorovodoničnom kiselinom, razblažiti vodom do 100ml i pre upotrebe dodati ditiotreitol do 100mmol/L).
● Aneks II
Analitička metoda za digestiju želatina (GDU)
A. Svrha: Ova procedura se koristi za određivanje proteolitičke aktivnosti bromelain enzima u prahu.
B. Oprema:
1. pH metar
2. Vodeno kupatilo konstantne temperature na 45.0 stepeni ± 0.1 stepen
3. Analitički bilans
4. Odmjerne tikvice
5. Volumetrijske pipete
6. Tajmer
7. Digitalna bireta (preciznost od 0.1 ml)
8. Napa
9. Automatske pipete
C. Sigurnosne mjere:
Ovaj test se mora izvesti u haubi.
1. Koristite standardne laboratorijske sigurnosne prakse.
2. Formaldehid: Pripremite i držite u dimnoj komori cijelo vrijeme. Poznati kancerogen i teratogen.
3. Peroksid: Jaki oksidant
D. Reagensi i pripreme reagensa:
1. Destilirana voda: približno 500 ml: podesite pH na 4,5 sa 0,1 N HCl.
2. Želatinski supstrat:
a. Rastvorite 25 grama želatine (Mikrobiologie. 1.04070) u 375 ml vrele vode, prokuhajte. Ohladiti na 45 stepeni.
b. Podesite pH na 4,5 sa 0.1 N HCl i razblažite do 500 ml destilovane vode sa pH 4,5.
c. Želatinski supstrat držite na 45 stepeni.
3. Bufer rješenje:
a. Polako dodajte 15 g NaCl u 40-50 ml vode u čaši od 150 ml i miješajte da se otopi.
b. Dodati 0.570 ml sirćetne kiseline.
c. Podesite pH na 4,5 pomoću 0.2N HCL (volumen će biti veći od 100 ml.)
4. 3 posto vodikovog peroksida:
a. Odpipetirajte 2,5 ml 30 postotnog vodikovog peroksida (osnovni rastvor) u odmjernu tikvicu od 25 ml i razrijedite do volumena s pH 4,5 destilovanom vodom
5. 37 posto formaldehida pH 9.0: a. Podesite dovoljnu zapreminu (100 ml) formaldehida na pH 9,0 sa 0,1 N NaOH (približno 20 ml formaldehida po uzorku pre podešavanja pH).
Analitička metoda jedinice za varenje želatina (GDU) - nastavak.
6. 0.100 N NaOH: (Kupljeno standardizovano) a. Osnovni rastvor: standardizovan na 0,100 N
E. Procedura:
1. Priprema enzima:
a. Izračunavanje preparata enzima
Težina {{0}}/Ciljana aktivnost (približno 0,05 g ili 50 mg)
A. Odmerite enzim precizno u volumetrijsku tikvicu od 50 ml
B. Dodati 8,3 ml puferskog rastvora.
b. Ostavite da odstoji 30 minuta na sobnoj temperaturi.
C. Razrijedite do 50 ml koristeći destilovanu vodu pH 4,5, dodajte malu šipku za miješanje i miješajte dodatnih 10 do 15 minuta
2. Enzimska procedura:
a. Odpipetirajte 25 ml želatinskog supstrata u svaku od dvije čaše od 100 ml koje sadrže šipke za miješanje i stavite ih u vodeno kupatilo na 45 stepeni na 5 minuta, jednu za testnu otopinu, a drugu za praznu otopinu.
b. Test rješenje:
1) Dodajte 1.0 ml otopine bromelain enzima u prahu u čašu namijenjenu za otopinu za ispitivanje, počnite mjerenje vremena i promiješajte.
2) Nakon tačno 20 minuta inkubacije na 45 stepeni, dodajte 0,1 ml 3% vodonik peroksida i promiješajte.
3) Inkubirajte dodatnih 5 minuta.
4) Izvadite čašu iz vodenog kupatila i uz stalno mešanje umetnite pH sondu.
5) Zabilježite pH nakon 10 sekundi (početni pH)
6) Podesite na pH 6.0 sa 0.1 N NaOH. (Približno 2-4 ml)
*Napomena: Kada podešavate pH na 6.0 budite oprezni na pH 5,8; pH se polako povećava i sitni dodaci NaOH u ovom trenutku će značajno povećati pH.
7) Uz stalno miješanje dodati 10 ml 37 posto formaldehida pH 9,0.
8) Zabilježite pH nakon 10 sekundi i 1 minute.
9) Titrirati do pH 9.0 sa 0.1 N NaOH.
10) Zabilježite volumen titracije.
Ovo je titar testa, T. c.
Prazno rešenje: Prazno rešenje treba da se pokreće istovremeno sa test rešenjem. Ovo se postiže pokretanjem određivanja praznog rastvora 12 minuta nakon pokretanja test rastvora. To vam daje vremena da dovršite analizu testnog rastvora pre nego što nastavite sa praznim rastvorom. 1) Dodajte 0.1 ml 3 posto vodonik peroksida u čašu koja je određena za slijepu otopinu i promiješajte.
2) Nakon tačno 20 minuta inkubacije na 45 stepeni dodajte 1,0 ml rastvora bromelaina i promiješajte.
3) Inkubirajte dodatnih 5 minuta.
ANALITIČKA JEDINICA ZA DIGESTIRANJE ŽELATINA (GDU) - nast.
4) Izvadite čašu iz vodenog kupatila i uz stalno mešanje umetnite pH sondu.
5) Zabilježite pH nakon 10 sekundi (početni pH)
6) Podesite na pH 6.0 sa 0.1 N NaOH. (Približno 2-4 ml)*Pogledajte napomenu iznad.
7) Uz stalno miješanje dodati 10 ml 37 posto formaldehida pH 9,0.
8) Zabilježite pH nakon 10 sekundi i 1 minute.
9) Titrirati do pH 9.0 sa 0.1 N NaOH.
10) Zabilježite volumen titracije. Ovo je prazni titar, B.
F. Obračun:
1. Definicija: Jedna jedinica za varenje želatina je ona količina enzima koja će nakon 20 minuta varenja na 45 stepeni osloboditi 1 mg amino azota iz standardnog rastvora želatina pri pH 4,5 ili pH 5,5 (GDU pH 4,5 ili pH 5,5).
GDU/g {{0}} (TB) x 14 x N x 50 Wt (g) Gdje: T=Titar testa (ml 0.1 N NaOH) B=Prazan titar (ml 0,1 N NaOH) N=Normalnost standardizovanog NaOH (tj. 0,100) Wt (g)=Početna težina enzima
G. Parametri testiranja:
1. Enzimski preparati se razblažuju do koncentracije od približno 0.001 g/ml (1 mg/ml) ili za koncentrat bromelain enzima u prahu približno 1-2 GDU/ml. Referentni materijal se analizira sa svakim ciklusom kako bi se osigurala tačnost metode.
Guanjie obezbeđuje rasuti bromelain u prahu, koristeći GDU metodu ispitivanja. Naš proizvodni proces radi u okviru CGMP standardnih radionica, koristeći tri proizvodne linije u dvije fabrike i dvije nezavisne laboratorije. Za sve upite u vezi s našim proizvodima, kontaktirajte nas nainfo@gybiotech.com.
